Fluorescein Labeling Kit – NH2试剂盒货号：LK01

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该试剂盒主要用于制备用荧光素标记的蛋白质，如免疫转染中的IgG和胞内蛋白示踪。氨基反应型荧光素是试剂盒的成分之一，它含有琥珀酰亚胺基（NHS），能与蛋白质或者其它分子的氨基反应。该试剂盒中包含了标记所需的全部试剂，包括Storage buffer。每一管荧光素最多能够标记200μg的IgG，每个IgG分子可与4-6个荧光素分子共价结合。该试剂盒还包含一个缓冲液交换系统，因此含有氨基缓冲液的样品也能用此试剂盒来标记。虽然用膜来过滤有时会导致IgG聚集，但是试剂盒中的缓冲液交换系统能够防止标记过程中聚集现象的发生。用该试剂盒标记的抗体在4℃下能够保存至少2个月。被荧光素标记后的IgG的激发和发射波长分别为495nm和520nm。

1）荧光素标记的产品可以在大约2小时内制备。

2）可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。

3）可以标记50至200μg的蛋白质。

4）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。

5）荧光素标记的物体可以与所附的存储溶液一起存储。

使用注意事项:

1. 用该试剂盒标记的蛋白质的分子量要>50,000。

2. 在标记过程中，IgG或者Fluorescein -IgG标记物始终存在于Filtration tube的滤膜上。

3. 如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质，如BSA或明胶时，在使用该试剂盒标记前，先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits（不包含于本试剂盒 中）来纯化。

4. 如果IgG溶液含有小的不溶物，离心后取上清液来进行标记。

5. 如果长时间不使用，建议您把试剂盒中的标记试剂NH₂-reactive fluorescein放在-20℃冰箱中保存，不需要充氮气，可以更好地保持标记试剂的活性，但请不要把其它试剂和过滤管放到-20℃冰箱中，仍请放在0-5℃冰箱中保存。

a) 样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于1mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100 μg。如果聚积过程中滤液的体积超过400μl，则在进行后续的离心操作前应除去滤液。
b) 如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5 min或者适当增加转速直至膜上没有残留液体。
c) NH2-Reactive Fluorescein Dye在管子的底部，向管底加入10μl DMSO，吹打数次使其溶解，如果没有DMSO的话，可以用乙醇来替代。
d) 如果IgG的量为200μg，在步骤4时加入所有的NH2-Reactive Fluorescein Dye溶液。
e) 并不一定要使用WS Buffer来回收标记产物，可以选择任何适合于该实验的缓冲液来替代。

计算标记率：

1分子蛋白质上结合的荧光素的数量 (标记率) 的计算方法：将标记的蛋白质溶液用5倍的中性缓冲液稀释，分别测定在280nm和各个荧光染料的最大吸收波长处的吸光度，采用以下公式计算。

* 如果是IgG，摩尔吸光系数ε=216,000。

* 荧光染料在WS缓冲液中的摩尔吸光系数参见下表：