PlasMem Bright Green细胞膜染色试剂货号：P504

细胞膜起着分隔细胞内和细胞外的作用，并且与细胞的移动和生长、神经信号的传达等细胞功能密切相关。因此，细胞膜的异常与各种细胞状态异常所造成的疾病（如离子通道病Channelopathy）有很密切的关联，被认为是非常重要的生物标记物之一。

由于操作简便并且可用于活细胞染色，小分子荧光探针是最常用的细胞膜染色方法。但是小分子荧光探针普遍存在细胞内停留时间短、水溶性差的问题。而PlasMem Bright是一种克服了现有小分子荧光探针问题的产品。 用PlasMem Bright观察细胞膜时，可以在染色后的1天以上进行长时间的荧光观察。

PlasMem Bright系列产品克服了现有市面上的细胞膜染色试剂的诸多缺点（细胞毒性高、停留时间短、不同实验系的兼容性差）。并且分别有Green/ Red两种产品，方便多重染色时自由选择。

产品名	细胞 毒性	染色后 的清洗	含血清 培养基	停留 时间	染色后 的固定
PlasMem Bright	低	不需要	可使用	24 h	可以(PFA)
S公司 产品P	–	需要	不可使用	–	可以
T公司 产品D	–	需要	可使用	–	不可以
T公司 产品C	–	需要	可使用	1.5 h	可以(PFA)

*通过细胞核染色试剂染色后，神经细胞的形态变化(凝集)的比较得出的结论

使用各种细胞膜染色试剂进行染色HeLa细胞，经过24 h培养后对各染色试剂的荧光图像进行比较。结果发现，与其他公司的细胞膜染色试剂相比，PlasMem Bright系列产品的染色时间更长，膜上的停留时间也更长。

实验例：ES细胞群内部的细胞膜染色

将小鼠ES细胞在涂有明胶的玻璃底皿中培养4天，并将获得的细胞群，用PlasMem Bright Green（200倍稀释）染色15分钟，并使用共聚焦显微镜（Zeiss：LSM710）中观察。

结果，细胞群内部的细胞膜也可以用PlasMem Bright Green可视化观察。

<观察条件>

细胞膜（PlasMem Bright Green【绿】）：Ex.488 nm/Em.500-560 nm.

*此实验例由庆应义塾大学医学院的石津 大嗣老师提供。

实验例：轴突神经细胞形态和线粒体定位的观察

由神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y分化诱导的神经细胞，分别用PlasMem Bright Green (绿)、MitoBright LT Red (红)、Hoechst 33342 (蓝) 进行染色。可以鲜明的观察到细胞的形状以及轴突内的线粒体。

（比例尺：200 μm）

<观察条件>

细胞膜（PlasMem Bright Green【绿】）：Ex.488 nm/Em.500-560 nm。

线粒体（MitoBright LT Red【红】）：Ex.561 nm/Em.560-620 nm。

细胞核（Hoechst33342【蓝】）：Ex.405 nm/Em.400-450 nm。

<实验步骤>

（1）诱导神经芽细胞（SH-SY5Y）为神经细胞。

（2）去除上清液，添加使用培养基中稀释200倍的PlasMem Bright Green、Hoechst 33342（终浓度：5μg/ml）以及MitoBright LT Red（终浓度0.1 μmol/l）。

（3）培养30分钟。

（4）去除上清液，添加HBSS。

（5）使用荧光显微镜观察。

实验例：神经芽细胞（SH-SY5Y）中的线粒体检测

分别用PlasMem Bright Green (绿)、MitoBright LT Red (红)、Hoechst 33342 (蓝) 对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y进行染色，用共聚焦显微镜获得3D图像。可以鲜明的观察到细胞形态以及线粒体和细胞核的情况。

（比例尺：10 μm）

<观察条件>

细胞膜（PlasMem Bright Green【绿】）：Ex.488 nm/Em.500-560 nm。

线粒体（MitoBright LT Red【红】）：Ex.561 nm/Em.560-620 nm。

细胞核（Hoechst33342【蓝】）：Ex.405 nm/Em.400-450 nm。

<实验步骤>

（1）使用HBSS清洗SH-SY5Y细胞。

（2）添加使用培养基中稀释200倍的PlasMem Bright Green、Hoechst 33342（终浓度：5μg/ml）以及MitoBright LT Red（终浓度0.1 μmol/l）。

（3）培养10分钟。

（4）使用HBSS清洗细胞2次

（5）使用荧光显微镜观察。

  实验例：脑源性小鼠神经母细胞瘤的延时成像

使用培养基中稀释200倍的PlasMem Bright Green，染色N1E-115细胞30分钟并进行延时成像时，可以清楚地观察到神经细胞内树突和突起中的变化。

<培养条件>

・细胞：N1E-115细胞（脑源性小鼠神经母细胞瘤）

・培养基：5％FBS，1％含谷氨酰胺的D-MEM（低葡萄糖）

・培养设备：35 mm 玻璃底皿

<拍摄条件>

・成像设备：带培养箱的荧光显微镜

・拍摄时间：1小时，拍摄间隔：2分钟

*此实验例由芝浦理工大学系统科学与工程学院的涌澤 充 様、福井 浩二教授提供。

 实验例：与外泌体共染色

向PlasMem Bright Green染色的HeLa细胞中加入外泌体膜荧光染色试剂盒(ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Red)染色的外泌体。可以观察到，由活细胞的细胞膜产生的内体(Endosome)中的外泌体，以及没有摄入外泌体的内体。另外，即使在固定染色的细胞之后，也可以像活细胞一样使存在于细胞膜来源的囊泡（内体）中的外泌体可视化。

(比例尺：5 μm）

(比例尺：10 μm）

<观察条件>

细胞膜 (PlasMem Bright Green, 绿)  Ex. 488 nm / Em. 500-560 nm。

外泌体 (ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Red, 红)  Ex. 561 nm / Em. 560-620 nm。

 

<实验步骤>

（1）接种Hela细胞，24小时培养。

（2）去除上清液，添加使用培养基稀释的PlasMem Bright Green（100倍稀释）。

（3）培养10分钟。

（4）使用HBSS清洗细胞3次。

（5）添加175 μlMEM培养基与ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Red染色过的Exosome溶液25 μl。

（6）在CO₂培养箱中过夜培养。

（固定情况下）细胞使用HBSS清洗2次后添加4%PFA，培养15分钟后，使用HBSS清洗细胞2次。

（7）使用共聚焦显微镜观察

 实验例：烟草BY2细胞的膜染色

用PlasMemBright Green (200倍稀释)染色烟草BY2细胞5分钟，清洗后每5分钟拍摄一次并进行长时间观察。实验中可以清晰的观察到BY2细胞膜的荧光以及细胞分裂所形成的细胞板。

(数据由名古屋大学栗原大辅老师友情提供)

<检测条件>

・转盘式共聚焦显微镜观察

・Ex: 488 nm; Em: 520/35 (502.5-537.5 nm)

・图中的时间按照00:00 (小时:分钟)表示

 

 实验例：拟南芥根的染色

用PlasMemBright Green (200倍稀释)染色拟南芥根15分钟，采用Z轴景深连续拍照的方法进行荧光观察，可以清晰的观察到立体的细胞膜分布情况。

 

(数据由名古屋大学栗原大辅老师友情提供)

<检测条件>

 

・转盘式共聚焦显微镜观察，Z轴摄影

・Ex: 488 nm; Em: 520/35 (502.5-537.5 nm)

 

Q1:   是否可以用固定化细胞？

A: 可以用4% 多聚甲醛(PFA)进行固定。 但是请注意不可以改变细胞膜的渗透性，否则会操造成没有荧光。

Q2:  是否可以进行动态荧光成像？

A:可以。   但是请注意将激发光保持在最低水平并提高检测灵敏度。另外，长时间的激发光照射可能会对细胞造成伤害，也更容易使荧光染料分解，请考虑采用时间间隔等方法尽量避免。

Q3:   在配制Working solution的时候是否可以用无血清培养基或Buffer进行稀释？

A: 可以。

Q1:  染色后清洗细胞时建议使用什么？

A: 无血清培养基、PBS、HBSS等各种缓冲液均可以使用。

Q4:   添加Working solution后，是否可以马上观察？

A:添加后马上观察也可以。操作手册上的步骤是加入试剂后培养5 min再观察。

Q5:   细胞膜以外的地方也有被染色的情况，请问是什么原因？

A: 感觉观察到细胞膜以外也被染色的情况，可能有如下两个原因 1) 细胞膜上的试剂，随着时间的推移，通过细胞内吞作用进入细胞内。 请参考本产品网页上“细胞膜上的停留时间”的部分，有染色后24 h的照片。 2）荧光成像时的焦点在底面(细胞底部的接触面)上，如下图A。 荧光成像时的焦点请尽量像下图B那样调整Z轴的高度。