MitoBright LT Deep Red试剂货号：MT12

细胞内有各种各样的细胞器，承担着各种各样必须的生命活动。其中线粒体不仅是通过氧化磷酸化反应生成ATP的场所，它还与癌症、细胞衰老、阿尔兹海默症、帕金森综合症等神经退行性疾病紧密相关，因此它是细胞内最重要的细胞器之一。

在对线粒体的形态和动态进行观察以及定量检测时，通常使用小分子荧光探针标记和荧光蛋白的基因转染两种方法。荧光蛋白的基因转染存在转染效率不稳定等情况，因此操作简便的小分子荧光探针的使用更为广泛。现在市面上销售的小分子荧光探针中，多为含有氯甲基的探针，该探针存在观察时间短，染色时不能使用含血清的培养基，染色后荧光背景高等问题。MitoBright LT荧光探针克服了这些问题，可在线粒体内稳定存在一天以上，条件合适的情况下可达到一周。而且与含有氯甲基的探针相比，染色后的荧光强度更高。本品直接采用DMSO溶液包装，可快速方便的进行线粒体染色。荧光颜色有Green, Red, Deep Red等多种选择，可满足多重染色等各种各样的实验要求。

1.可长时间在细胞内存在

用HBSS清洗HeLa细胞后，分别用MitoBright LT和其他公司的试剂进行染色，更换含血清的培养基，培养4天后观察线粒体染色情况。其他公司的染色试剂在4天后荧光强度大幅降低，而MitoBright LT依然维持着高荧光强度，并且在染色7日后依然可以观察到荧光。

＜检测条件＞

MitoBright LT Green 、（T公司）Green：Ex 488 nm/Em 500–560 nm

MitoBright LT Red 、（T公司）Red：Ex 561 nm/Em 560–620 nm

MitoBright LT Deep Red 、（T公司）Deep Red：Ex 640 nm/Em 650–700 nm

2.可以使用含血清培养基

用MitoBright LT和其他公司试剂，分别用含有血清和不含血清的培养基染色。其他公司试剂在含有血清的培养基染色时，荧光明显减弱，而MitoBright LT在含有血清的培养基条件下，荧光没有减弱，可明显观察到线粒体的染色情况。

实时荧光观察

HeLa细胞用CCCP处理，并与线粒体检测试剂（Mtphagy Dye）和线粒体染色试剂（MitoBright LT Green）共同染色，并经过一段时间（6小时）后进行检测。

<检测条件>

设备：LSM-700 Laser scanning confocal microscope (LSCM)

(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)

激发波长：

MitoBright LT Green 488 nm

Mtphagy Dye      555 nm

物镜：63x

拍摄时间：6小时

拍摄间隔：15秒

用流式细胞仪检测

1. 用RPMI培养基(10% Fetal Bovine Serum, 1% Penicillin-Streptomycin)配制Jurkat细胞悬液(3.2×10⁵cell/ml)接种于5 cm培养皿中，在37℃，5% CO₂培养箱内过夜培养。

2. 去除培养基，加入MitoBright LT Working Solution (0.1 μmol/l, 5 ml)， 在37℃培养30分钟。

3. 去除溶液，用 5 ml的PRPMI培养基清洗细胞2 次。

4. 更换RPMI培养基，持续培养细胞，每隔2 天用流式细胞仪检测。

 MitoBright LT Green                                   MitoBright LT Red                                     MitoBright LT Deep Red

                        Excitation: 488 nm                                      Excitation: 488 nm                                     Excitation: 633 nm      

                        Emission: 515-545 nm                                Emission: 564-604 nm                               Emission: 650-670 nm

在胶原蛋白涂覆玻璃板上观察线粒体荧光成像

胶原蛋白涂覆玻璃板通常用于线粒体形态的高倍放大观察。

现有的线粒体染色试剂存在吸附胶原蛋白和升高背景的问题，但是MitoBright LT系列可以在不受背景影响的情况下清楚地对线粒体进行染色。

<染色条件>

将HeLa细胞接种在胶原蛋白涂覆玻璃板上，培养24小时，提取上清液并用HBSS洗涤。

加入100 nmol/l的MitoBright LT Green工作溶液，培养30分钟后，提取上清液并用HBSS洗涤后用荧光显微镜观察。

<检测条件>

Ex 488 nm，Em 500-560 nm

<结果>

现有的线粒体染色剂存在吸附胶原蛋白和升高背景的问题，但是MitoBright  LT系列可以清晰地对线粒体染色，而不受背景影响。

通过超分辨率激光显微镜（STED）观察线粒体内部构造

线粒体疾病致突变的Cybrid细胞用MitoBright-LT-Deep Red染色，用超分辨激光显微镜(STED)观察，证实线粒体嵴结构异常。

＜实验条件＞

色素：MitoBrightLT Deep Red（100 nmol/l）

仪器：Leica超分辨率激光显微镜TCS SP8 STED 3X

Ex. 640 nm / Em. 650-700 nm

STED激光：775nm

 

<实验步骤>

1将细胞接种在玻璃培养皿中，培养2天（37℃，5% CO₂）。

2去除培养基后，加入使用L-15培养基（含10%FBS）制备的MitoBrightLT Deep Red（100 nmol/l）工作液。

3孵育45分钟（37度，5% CO₂）。

4去除上清液，用HBSS清洗两次。

5加入L-15培养基（含10%FBS），通过超分辨率激光显微镜（Leica TCS SP8 STED）进行观察。

以上数据由东京都老年学研究所衰老控制研究小组的大澤郁朗博士和藤田泰典博士友情提供。