NEB代理 , DNA修饰酶与克隆技术 , DNA 修复蛋白,切割错配核酸内切酶 I#M0678S

产品资料 – DNA修饰酶与克隆技术 – DNA 修复蛋白

切割错配核酸内切酶 I

#M0678S 4,000 units

产品特点

 NEB代理 , DNA修饰酶与克隆技术 , DNA 修复蛋白

• DNA 核酸内切酶
• 催化切割一些 DNA 错配(T:T,G:G 和 G:T)
• 在两条链上错配碱基 5端的第三个磷酸二酯键处切割,切割后产生 5 bp 粘性末端,含 3′-OH 和 5′- 磷酸
• 对于 T 错配切割效果最好;无法识别所有类型的 DNA 错配

产品描述

切割错配核酸内切酶 I 是一种依赖 Mg2+ 的 DNA 核酸内切酶,可特异切割错配碱基对(T:T、G:G 和 T:G 错配)。切割错配核酸内切酶 I 在两条链上错配碱基 5端的第三个磷酸二酯键处切割,切割后产生 5 bp 粘性末端。切割错配核酸内切酶 I 优先切割的 DNA 错配为:T:T、G:G 和 T:G,也可轻松切割 T:I、G:I 和 G:U 错配。此外,实验证明:切割错配核酸内切酶 I 在 T:C 类型的 DNA 错配中可在含 T 的链上形成切刻。该酶还能切割 DNA:RNA 杂交链上的 T:G 和 T:U 错配,但其切割效率低于 DNA:DNA 错配。

 

图 1.切割错配核酸内切酶 I 能够切割双链 DNA 上的 T:T、G:T 和 G:G 错配
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A)构建四个在同一位点包含特定突变质粒(p1-p4),使用差异磷酸化引物(正向或反向)扩增生成 8 个双链 PCR 片段,长度约 672 bp ds1-ds8)。经 Monarch PCR & DNA 纯化试剂盒(NEB #T1030)纯化后,使用 5 units Lambda 核酸外切酶,经37℃孵育 60 分钟,以特异性降解双链片段中的磷酸化链(2.2 µg),从而产生一系列单链(正链/负链),同一位点碱基为 A/T/C/G。随后使用 Monarch PCR & DNA 纯化试剂盒(NEB #T1030)对这些单链片段(ss1-ss8)进行纯化。

B)将纯化后的含有 A/T/C/G 的单链片段进行混合,可形成精准配对的 DNA(绿色 √ 框)或含单碱基错配的双链片段(黄色 × 框)。为了生含错配碱基的双链,在下述条件下,选择特定的正/反义链进行混合:在 1X NEBuffer 2.1 中重新退火,加热至 95℃,再冷却至室温。上述实验可产生 8 DNA 错配(A:AA:CA:GC:CC:TG:GG:TT:T)。(C)如下方法检测该酶切割 dsDNA 中特定错配的能力:在 200 ng 含错配的 dsDNA 中加入 80 units 切割错配核酸内切酶 I37℃孵育 30 分钟。后将产物进行琼脂糖(1.2%)凝胶电泳并用溴化乙锭染色观察。

图 2.切割错配核酸内切酶 I 能够切割双链 DNA 上的 T:T、G:T 和 G:G 错配 

 

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使用前端带有 FAM 荧光标记(蓝色示踪染料),末端带有 ROX 荧光标记(红色示踪染料)的双链 DNA 片段与80 units 切割错配核酸内切酶 I(+M0678)在 NEBuffer r2.1 中,37℃孵育 30 分钟,用于测定切割错配核酸内切酶 I 切割 dsDNA 中特定错配的能力。样品经毛细管电泳分析显示:酶解样品(+M0678 样品)与未经酶处理的样品(-M0678)相比,T:T、G:T 和 G:G 错配的底物峰发生偏移。此外,在 30 分钟内即可看到 T:C 错配中的含 T 链(蓝色链)出现一些轻微切割。该酶在 T:C 错配底物上的切刻活性随着时间的推移而增加(最多 18 小时,本数据未显示)。