L256/Lactate Assay Kit-WST试剂盒

货号:L256
乳酸检测试剂盒
Lactate Assay Kit-WST
储存条件:0-5度保存,避光
运输条件:室温

特点:

细胞上清液和细胞样品均适用
操作简便
灵敏度高最低可检测到0.02 mmol/l的乳酸
试剂稳定性高
享有显色底物WST专利

选择规格:50 tests,200 tests

关联产品TOP5

NO.1. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.2. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.3. Glucose Assay Kit-WST 葡萄糖检测
NO.4. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测
NO.5. MitoPeDPP 线粒体内脂质过氧化物检测

试剂盒内含

50 tests Dye Mixture
-Lactate Standard
·Enzyme Solution
-Assay Buffer
-Reconstitution Buffer
x1
150 ulx1
12 ulx1
5.5 mlx1
550ul x1
200 tests – Dye Mixture
Lactate Standard
-Enzyme Solution
·Assay Buffer
-Reconstitution Buffer
x1
600 ul x1
48 ulx1
11 mlx2
2.2 mlx1

概述

乳酸是细胞的一种主要代谢途径-糖酵解的代谢产物,也是肌肉疲劳和高乳酸血症的重要生物标志物。它还可以作为监测细胞内代谢途径变化的标志物。此外最近的代谢研究表明,乳酸是组织和癌细胞的三羧酸循环中碳的主要来源。

Lactate Assay Kit-WST®可用于定量检测糖酵解代谢产生的乳酸,并优化了定量过程。本试剂盒通过测定WST®的显色反应来定量细胞上清液中的乳酸含量,可用96孔板检测,灵敏度高,最低可检测到0.02 mmol/l的乳酸。

WST®:WST是日本同仁化学研究所的注册商标

原理

本试剂盒通过测定WST的显色反应来定量细胞上清或细胞内的乳酸含量。

另外,试剂盒中含有乳酸标准液,可以通过制备标准曲线来定量样品中的乳酸浓度。

特点

特点1:操作简单,只需要加入试剂

只需在加入细胞裂解液的细胞上清液中加入试剂,培养即可。

特点2:试剂稳定性高

乳酸标准曲线

可以从使用试剂盒中的乳酸标准液制作出乳酸标准曲线,然后通过标准曲线求出样品中的乳酸浓度。

当乳酸浓度在1 mmol/l以上时,可以通过稀释样品进行检测。

实验例

2-脱氧-D-葡萄糖对糖酵解的抑制作用 

1、在96孔板中接种1×104个/孔的HeLa细胞(MEM培养基中含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素),在37℃,5% CO2培养箱中过夜培养。

2、去除上清液后,在培养基中加入100 µl配制好的系列浓度的2-脱氧-D-葡萄糖溶液。

3、在37℃,5% CO2培养箱中过夜培养。

4、培养后,吸取20 µl细胞上清液至1.5 ml微量管中,并用超纯水稀释8倍制备样品溶液,然后按照说明书的图3在每孔中加入20 µl样品溶液。

5、按照“配制乳酸标准液”的方法配制乳酸标准液。

6、在96孔板中按照说明书的图3在每孔中加入20 µl各种浓度的乳酸标准液。

7、在每孔中加入80 µl工作液。

8、在37℃培养箱中培养30 min。

9、用酶标仪测定450 nm的吸光度,并用标准曲线计算样品的乳酸浓度。

2-脱氧-D-葡萄糖对糖酵解的抑制作用,随着2-脱氧-D-葡萄糖 (一种糖酵解抑制剂)浓度的增加,乳酸浓度逐渐减少

葡萄糖和乳酸的测定例

用葡萄糖测定试剂盒(货号:G264)和乳酸测定试剂盒检测(货号:L256):检测将葡萄糖转运蛋白抑制剂Phloretin添加到Jurkat细胞时的代谢活性变化。

■实验条件

细胞:Jurkat细胞(5×105细胞)

药物:Phloretin(终浓度:100 µmol/l)

培养时间:过夜培养

■结果

Phloretin的添加抑制了葡萄糖的摄取,减少了葡萄糖的消耗,增加了培养基中葡萄糖的量,并减少了乳酸的量。

常见问题Q&A

Q:使用含有血清的培养基,可以测定培养上清液中的乳酸吗?
A:使用含有血清的培养基,可以测定培养上清液中的乳酸。
但是在含有血清的情况下,由于背景上升,需要测定培养基OD值并将其作为背景对照减去。
【参考数据】
含和不含10%FBS的吸光度比较

<结果>
在培养基中加入10%FBS的组吸光度大大升高,因此需要测定培养基作为背景对照。
Q:如何检测细胞内乳酸含量?
(1)用微量管收集1×105的细胞*1。

(2)以300×g离心2 min后去除上清液。

(3)加入300 μl的PBS,用移液器吹打使其重悬,再以300×g离心2 min后去除上清液。
(4)加入300 μl细胞裂解液*2(0.1%Triton-X)并涡旋1 min,制成细胞裂解液。

(5)以8000×g离心5 min,收集上清液。
(6)将步骤(5)所得溶液用超滤离心管(PALL,No.OD010C3,滤膜分子量:10K)以12,000×g 离心10 min*3去除蛋白质,得到待测样品。

*1、样品为HeLa细胞时,为了检测出0.02 mmol/l以上的乳酸含量,需要1×105的细胞甚至更多。
*2、如果细胞裂解液中含有SDS会抑制显色,因此不要使用含有SDS的缓冲液。

*3、内源性乳酸脱氢酶(LDH)会导致背景增高,因此通过脱蛋白处理去除内源性乳酸脱氢酶

(LDH)。
※测定样品设定为3个复孔时(n=3),合计至少需要60 μl以上(每孔20 μl×3)。
※如果过滤后滤液不足60 μl,可适当延长过滤时间。
※稀释细胞裂解液至合适的浓度,使结果在标准曲线范围内(0-1 mmol/l)。

Q:配制后的Working Solution稳定性如何,可以保存多久?
A:Working Solution需要现配现用。
光会影响Working Solution的稳定性,所以配制后请用铝箔纸包裹。
配制后的Working Solution在室温避光条件下可以保存4 h。
(Working Solution遇到光,溶液的颜色会由红色变为橙色,背景会升高。)
Q:为什么我的样品孔没有显色?
A:样品中的乳酸浓度可能低于检测限(0.02 mmol/l)。
乳酸浓度低于0.02 mmol/l的样品无法用该试剂盒检测,因此请考虑其他方法,如LC-MS。
如果待测样品被稀释,则稀释样品中含有的乳酸浓度可能低于0.02 mmol/l。
请降低稀释比例,从而将检测样品的乳酸浓度调整到最低检测限以上。
Q:是否可以检测含有还原性物质的样品?
A:如果样品中含有还原性的物质,则WST染料也会发生显色,此时无法准确定量乳酸浓度。
实验中如遇到以上情况,可以设定药物对照(不含细胞含药物的培养基+试剂),
并将标准品孔和样品孔的吸光度分别减去药物对照的吸光度。
Q:该试剂盒可以定量D-Lactate吗?
A:该试剂盒是用于L-Lactate的定量,不能定量D-Lactate。
Q:是否可以使用450 nm以外波长的滤光片进行检测?
A:也可以使用490 nm的滤光片, 但是吸光度会低于在450 nm处的吸光度。
Q:一个试剂盒可以检测样品的数量。
A:制备标准曲线和样品(n=3)时,可以检测的样品数量如下所示。

标准曲线:8个点(0, 0.0157, 0.0313, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1 mmol/l)(n=3)

96孔板排列示意图(n=3)

参考文献

1)Metabolome analysis reveals excessive glycolysis via PI3K/AKT/mTOR and RAS/MAPK signaling in methotrexate-resistant primary CNS lymphoma-derived cells, Clin. Cancer Res., 2020, DOI:10.1158/1078-0432.

2)Serine racemase enhances growth of colorectal cancer by producing pyruvate from serine,Nat. Metab.,2020, 2(1), 81.

3)Novel pharmacological effects of poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib on the lactate dehydrogenase pathway, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2019, 510, (4), 510.

4)PDH-mediated metabolic flow is critical for skeletal muscle stem cell differentiation and myotube formation during regeneration in mice, FASEB J.,2019,33,(7), 8094.

5)Tumor Cell-Derived Angiopoietin-Like Protein 2 Establishes a Preference for Glycolytic Metabolism in Lung Cancer Cells,Cancer Science, 2020,111(4):1241-1253.

6)2-Deoxy-D-glucose enhances the anti-cancer effects of idarubicin on idarubicin-resistant P388 leukemia cells, Oncol. Lett., 2020, 20(1), 962-966.