N509/NAD/NADH Assay Kit-WST试剂盒

货号:N509
NAD/NADH检测试剂盒
NAD/NADH Assay Kit-WST
储存条件:0-5度保存,避光防潮
运输条件:室温

特点:

数据可靠,不会与NADP及NADPH反应
同一样品可以用Lactate Assay Kit-WST(货号:L256)测定上清液中乳酸含量
只有Dojindo的试剂盒中带有可以简单去除蛋白质的微量管
享有显色底物WST专利

选择规格:100 tests

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试剂盒内含

100 tests
-NAD/NADH Extraction Buffer 20 ml×1
-NAD/NADH Control Buffer 20 ml×1
Standard Buffer 10 ml×1
Assay Buffer 5.5 ml×1
– Dye Mixture 550ul×1
Enzyme x1
Standard x1
·Filtration Tube x12

概述

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是参与糖酵解、电子转移系统和TCA循环等细胞主要代谢途径氧化还原反应的重要辅助因子。NAD以氧化型NAD+和还原型NADH的形式存在于细胞中。维持适当的NAD+和NADH水平对细胞功能至关重要。此外最近的研究表明NAD+水平的下降与衰老相关,NAD+的量被认为是衰老相关研究的一个标志。

NAD/NADH检测试剂盒可以定量细胞中NAD+/NADH、NADH和NAD+的量,并测量它们的比值。细胞内NADH水平可以通过试剂盒内含的Extraction Buffer裂解细胞并在加热后选择性地定量检测。而细胞内的NAD+水平则可以通过总的NAD+/NADH总量减去NADH量计算得到。

原理

技术情报

NAD+和NADH的分别检测

分别测定NAD+和NADH的操作步骤

*只有Dojindo的试剂盒中带有可以简单去除蛋白质的微量管

用试剂盒内的提取缓冲液及去除蛋白质用的微量管,能简便地制备细胞裂解液。通过加热细胞裂解液能单独检测细胞内的NADH量。而细胞内的NAD+量则可以通过总NAD+/NADH量减去NADH量的计算得到。

在本试剂盒中,当n=3时,可以测量12个样品和8个标准品。当使用超过12个样品时,您需要准备单独的微量管。

使用NAD+/NADH作为指标的研究

细胞中NAD+和NADH的量被评估为重要的代谢指标,用于了解受药物管理和基因重组影响的癌细胞和线粒体功能。最近已经明确了长寿相关的受体与NAD+的含量密切相关。越来越多的人将其评估为肥胖,糖尿病和细胞分化等生物学状况的标志物。

检索来源:Google Scholar

检索关键词:

NAD/NADH    :  “NAD/NADH”

线粒体             :“NAD/NADH”Mitochondria

癌                    :“NAD/NADH”Cancer

肥胖                 :“NAD/NADH”Obesity

孔板检测中数据的可靠性

可以通过同时测量该试剂盒中包含的标准溶液来进行定量分析。如果样品中NAD+/NADH的总含量高于2 μmol/l,则可以通过稀释样品进行评估。在下面的实验中,使用细胞数相差2倍的HeLa细胞,来确定NAD+和NADH的数量和比率。

使用增殖培养的HeLa细胞(2.5×105,5.0×105个细胞),从标准曲线中得到细胞内NAD+和NADH的量。最终NAD+的量和NADH的量会随着细胞数而改变,但是即使细胞数改变,NAD+和NADH量的比率也不变。

经确认,将2-Deoxy-D-glucose加入到HeLa 细胞后,代谢活性发生了变化。

用乳酸检测试剂盒检测的实验例

向HeLa细胞(1×106细胞)中加入2-Deoxy-D-glucose,终浓度为6 mmol/l,培养24小时后测定乳酸量和NAD+/NADH比。用Lactate Assay Kit-WST(货号:L256)测定上清液中乳酸含量,去除上清后用本试剂盒检测细胞中的NAD+/NADH比。

最终加入2-Deoxy-D-glucose抑制了细胞内糖酵解系统,并导致乳酸量的减少和NAD+/NADH比率的增加。

操作步骤

(1) 按照上图,在每孔中分别加入50 μl的标准液和样品溶液。

※为了获得准确的数据,建议每个样品做3个复孔。

(2) 在每孔中加入50 μl Working Solution。

※由于在加入Working Solution后酶会立刻反应,请用多通道移液器以减少由于加液时间延迟而导致的实验误差。

(3) 在37℃培养60 min。

※培养时请密封培养板,以防止液体蒸发。

(4) 用酶标仪在450 nm处检测吸光度。

(5) 用标准曲线测定样品中总NAD+/NADH和NADH的量。

※如果原样品在检测前已稀释,可用稀释倍率乘以检测的数值。

※NAD+的量可用总NAD+/NADH的量-NADH的量计算得到

NAD+= 总NAD+/NADH-NADH

                                                标准曲线

常见问题Q&A

Q1:试剂盒可以测量多少个样本?
A1:

*所有样品均测定3次(n=3)

上表中显示了当标准样品从2 μmol/l连续稀释,作出一条共计8个点(n=3)的标准曲线时可以检测的样品数量。如果分为2次检测,由于需要重复做一条标准曲线,因此样品检测的数量会更少。
Q2:是否可以使用450 nm以外的滤光片进行测量?
A2:也可以使用490 nm的滤光片,但是吸光度会低于在450 nm处的吸光度。当用不同滤光片检测时,校准曲线如下:

Q3:可以单独购买过滤管吗?
A3:不可以,我们不单独出售过滤管。如果需要其他耗材,可以使用市场上售卖的过滤管。
Q4:工作液稳定吗?
A4:工作液无法长期保存。请在使用前配制工作液,由于工作液对光敏感请注意避光。该工作液在室温下可避光保存4小时。
Q5:样品颜色没有变化,是什么原因?
A5:样品中的NAD含量可能低于使用此试剂盒可测定的检测限度,在这种情况下,请增加细胞数,或者如果检测样品被稀释,则在检测前降低稀释比例。

参考文献

No            检测对象                                              文献名
1       老年小鼠肠道

上皮组织器官

Epigenetic silencing of Lgr5 induces senescence of intestinal epithelial organoids during the process of aging, NPJ Aging Mech. Dis.,  2018,doi:10.1038/s41514-018-0031-5.
2         成人T细胞

白血病细胞株

High expression of   NAMPT in adult T-cell leukemia/lymphoma and anti-tumor activity of a NAMPT inhibitor, Eur. J. Pharmacol., 2019,865,172738.
3         Sirt 7敲除

成纤维细胞

SIRT7 regulates the nuclear export of NF-κB p65 by deacetylating Ran,

Biochim. Biophys. Acta. Mol. Cell Res.,2019,1866(9),1355.

4         人iPS来源神经细胞 Kynurenine,3-OH-kynurenine, and anthranilate are nutrient metabolites that alter H3K4         trimethylation and H2AS40 O-GlcNAcylation at hypothalamus-related loci,

Sci. Rep., 2019, 9(1), 19768.

5         HuH-7细胞 Contribution of GPD2/mGPDH to an alternative respiratory chain of the mitochondrial         energy metabolism and the stemness in CD133-positive HuH-7 cells,

Genes Cells,2020, 25(2), 139.

6         HeLa细胞  Hypoxia promotes Chlamydia trachomatis L2/434/Bu growth in immortal human epithelial cells via activation of the PI3K-AKT pathway and maintenance of a balanced NAD+/NADH     ratio, Microbes Infect., 2020, DOI:10.1016/j.micinf.2020.04.010.