MT14/mtSOX Deep Red – Mitochondrial Superoxide Detection

        线粒体在生成ATP的同时会生成超氧化物。正常情况下，细胞的抗氧化酶等物质会保护细胞免受活性氧的伤害。但是，当线粒体功能异常时，活性氧过量积累会造成细胞的各种机能紊乱。因此在评价细胞氧化应激水平时，往往需要同时检测线粒体的膜电位和线粒体的活性氧。

对各种活性氧的反应选择性

mtSOXDeep Red相较于T公司的产品Red，在各种活性氧中，对超氧化物的选择性更高。

另外，与其他公司产品所不同的是，mtSOX  Deep Red拥有独特的荧光特性(λex: 540 nm; λem: 670 nm)，可以同时进行线粒体膜电位检测试剂(JC-1 货号MT09; MT-1 货号MT13)的共染色实验。

线粒体超氧化物和线粒体膜电位的同时检测

用HBSS清洗HeLa细胞后，使用mtSOX和同仁化学研究所的线粒体膜电位检测试剂(JC-1 货号MT09或MT-1 货号MT13)进行共染色实验，同时观察线粒体ROS和线粒体膜电位。

结果显示，伴随着线粒体ROS的产生，线粒体膜电位也逐渐降低。

<使用JC-1的实验操作>

<检测条件>

JC-1:绿Ex=488 nm; Em= 490-520 nm; 红Ex=561 nm; Em= 560-600 nm

mtSOX:Ex=633 nm; Em= 640-700 nm

Scale bar: 10 μm

<检测条件>

JC-1:绿Ex=485 nm; Em= 535 nm; 红Ex=535 nm; Em= 595 nm

mtSOX:Ex=550 nm; Em= 675 nm

<使用MT-1的实验操作>

<检测条件>

MT-1: Ex=561 nm; Em= 560-600 nm

mtSOX:Ex=633 nm; Em= 640-700 nm

Scale bar: 10 μm

<检测条件>

MT-1: Ex=545 nm; Em= 600 nm;

mtSOX:Ex=550 nm; Em= 675 nm

细胞内Total ROS和线粒体超氧化物的同时检测

用HBSS清洗HeLa细胞后，使用mtSOX和同仁化学研究所的细胞内ROS检测试剂(ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA- 货号：R252)进行共染色实验，通过线粒体超氧化物诱导剂Antimycin或过氧化氢诱导后进行荧光观察。

结果显示，可以分别观察到细胞内ROS诱导后的荧光增强和线粒体的ROS诱导后的荧光增强。

<实验操作>

<Antimycin刺激的结果>

<检测条件>

细胞内ROS:  Ex=488 nm; Em= 490-520 nm

mtSOX:Ex=633 nm; Em= 640-700 nm

Scale bar: 10 μm

常见问题Q&A

Q1：mtSOX Deep Red的检测原理是什么？
A1：mtSOX Deep Red被Superoxide特异性氧化后会发出荧光，同时它还可在线粒体处积累，因此可以检测线粒体Superoxide。伴随着Superoxide的增加，线粒体的膜电位消失的话，核小体和细胞质会被染料染色。
Q2：每个试剂盒可以检测多少个样品？
A2：可检测的样品数如下。
・ 96-well plate: 1块。
・ ibidi 8-well plate: 6块。
・ 35 mm dish: 5块。
Q3：是否可以用培养基以外的溶液配制Working solution？
A3：可以，可使用HBSS或PBS代替培养基。
Q4：各检测仪器适用的滤光片？
A4：荧光显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪均可检测。
・激光共聚焦显微镜
Ex/Em: 561/640-700 nm (无红色荧光染料共染时)
Ex/Em: 633/640-700 nm (与红色荧光染料共染时)
・荧光显微镜
TxRed Filter
・荧光酶标仪
Ex/Em: 535–565/660–690 nm
Q5：是否可以刺激后再染色？
A5：在线粒体膜电位正常的前提下是有可能的。
本染料依赖线粒体膜电位在线粒体处积累，因此如果药物刺激造成线粒体膜电位降低的话，染料将无法在线粒体处积累，影响检测结果。因此推荐先染色再进行药物刺激。